花器官液泡pH對花色的影響

在花青素類觀賞植物中，顯色物質(zhì)組成相同，顯色物質(zhì)存在的狀態(tài)不同，呈現(xiàn)的花色不同。保持這類植物顯色物質(zhì)穩(wěn)定性的方式有花色苷的自締合作用和花色苷與輔色素結合的共色素沉著作用。自締合作用中多個花青素發(fā)色團疊加在同一個左旋軸上，不同角度的遷移導致分裂的圓偏光二色性曲線產(chǎn)生，即光譜有不同的紅移或藍移趨勢（圖1）；共色素沉著是顯色物質(zhì)疏水堆積使結構穩(wěn)定，對花色苷與輔色素濃度、種類有要求，即濃度越高，疏水力越強，顯色物質(zhì)越穩(wěn)定，顏色可由紅向藍紫移動。這些全部依賴于一定的液泡pH，液泡pH改變時水合能力改變，著色物質(zhì)為適應水合環(huán)境，調(diào)整自身使其穩(wěn)定，顏色發(fā)生改變。合適的花色苷與輔色素形成共色素沉著后，還可避免花色苷不穩(wěn)定的無水堿基形成甲基醇從而不顯色，且pH在3-6的區(qū)間內(nèi)輔色素槲皮苷才能和花色苷、金屬離子形成絡合物。

大豆紫花胞液pH為5.73-5.77，而藍花胞液pH為6.07-6.10。類似地，矮牽牛紅色花花瓣勻漿pH在5.5左右，而紫色花瓣勻漿pH在6.0左右；飛燕草花瓣表皮組織在紫紅色時pH為5.5，紫藍色時pH為6.6。另外，一些植物花瓣液泡的pH也顯示出類似的變化趨勢。日本牽牛從花蕾到綻放，花瓣液泡pH一直升高，花蕾時期紫紅色的細胞液泡pH為6.6，而開花后藍色細胞液泡的pH為7.7；同樣，在八仙花上，用質(zhì)子選擇微電極精準測量著色細胞液泡，藍色花的液泡pH均值為4.1，而紅色花為3.3。葡萄風信子的穗狀花序上半部分為藍色，下半部分為紫色，紫色部分的勻漿pH為5.84，藍色部分為5.91。葛根花序上同時有不同時間開放的花，新開的花為紫紅色，pH為5.2，老花為紫羅蘭色，pH為5.5。

自然界中沒有藍色月季花，月季的DRF基因無法將二氫楊梅酮作為底物反應生成飛燕草素花色苷，致使無藍色月季的誕生。研究人員在試驗了多種月季品種后選擇了輔色素含量和液泡pH均高的品種作為寄主，將三色堇的F3′5′H基因與荷蘭鳶尾的DFR基因構建二元載體導入寄主，在月季DFR基因SiRNA表達的共同作用下，寄主花瓣最終呈現(xiàn)淡紫色。這對藍色月季的培育具有里程碑式的意義。由此可以得出結論，除飛燕草素花色苷外，較高的液泡pH與高含量的輔色素也是藍色月季花形成必不可少的元素，這兩個重要因子在在仙客來、菊花和康乃馨上同樣有所印證。

圖1花色苷堆積偏旋模式及CD曲線展示

調(diào)控花器官液泡pH的分子機理

在水稻和玉米上發(fā)現(xiàn)，將原來的pH為5.0的營養(yǎng)液調(diào)至pH為8.5，兩種作物根部液泡pH均出現(xiàn)一定的下降趨勢，5-10 min后恢復原來的pH；在玉米營養(yǎng)液中加入NH3，使營養(yǎng)液pH升至8.5，玉米根部液泡pH由5.5左右升至6.1左右，并穩(wěn)定下來；在水稻營養(yǎng)液中加入NH3，水稻根部液泡pH由5.4左右升至5.9左右，很快恢復至pH為5.4左右，并趨于穩(wěn)定，這表明液泡具有一套隔離外界環(huán)境、獨立調(diào)控內(nèi)部pH的系統(tǒng)。

由于著色細胞液泡的pH在花色調(diào)控中起重要作用，因此研究調(diào)控花器官液泡pH的分子機理對于花色調(diào)控具有非常重要的價值。前人在調(diào)控著色細胞液泡pH的研究中，以日本牽牛與矮牽牛作為模式植物，闡明了著色細胞液泡堿化與酸化的分子機理。

液泡酸化

野生型矮牽?；ü诔始t色，矮牽牛突變體出現(xiàn)與原有表型有色差的扇形色塊，或花冠整體顏色偏紫。研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色區(qū)域，其液泡pH也不同。

通過進一步分離雜交實驗，共分離出PH1-PH7 7個調(diào)控著色細胞液泡pH酸化的基因。其中PH4編碼R2R3 MYB蛋白（myeloblastosis蛋白），PH6（后更名為AN1）屬于bHLH蛋白（basic helixloop-helix蛋白），這兩個蛋白與WDR蛋白（WD是由40個氨基酸組成，以色氨酸W、天冬氨酸D結尾的結構域；WDR是WD重復）AN11結合，形成MBW（MYB-bHLH-WD）復合物，調(diào)節(jié)花青素晚期合成通路；PH4-AN1-AN11還激活PH3轉(zhuǎn)錄，PH3編碼WRKY蛋白（含WRKYGQK 7個保守的氨基酸序列和16個氨基酸的鋅指結構域的轉(zhuǎn)錄因子），可與AN11綁定，與PH4-AN1-AN11形成復合蛋白，在前饋環(huán)中轉(zhuǎn)錄PH5，同時，PH1也受PH4-AN1-AN11以及PH3的調(diào)控（圖2）。PH5表達還受AN2轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控；PH1、PH5表達均略晚于DRF基因的表達，可能是因為PH1、PH5表達需要花青素積累；PH1、PH5表達不影響花青素種類、數(shù)量及結構的變化，不影響細胞形狀］。

矮牽牛在PH3調(diào)控下花冠呈紅色，ph3突變體中，PH1、PH5表達減少，花冠表皮著色細胞液泡pH升高，顏色呈灰紫色。即使PH5過表達，也不足以使突變體表型恢復正常，但是當PH1也同時過表達時，ph3突變體可以恢復正常表型。這說明PH1、PH5形成復合體后，向花冠表皮著色細胞液泡泵入H+的能力成倍提高。PH5編碼一個P3AATPase質(zhì)子泵，該質(zhì)子泵主要負責向花冠表皮著色液泡泵入H+。PH1編碼的P3B-ATPase，缺乏陽離子結合與易位的關鍵——保守天冬氨酸殘基，故不能行使質(zhì)子泵功能，故液泡酸化過程中作為PH5的輔因子，與PH5形成雜聚肽復合物，共定位于花冠表皮著色液泡上，增強PH5轉(zhuǎn)運H+的能力，實現(xiàn)液泡高酸化。PH1、PH5的同源基因廣泛分布于被子植物中。

圖2 PH基因編碼蛋白調(diào)控液泡酸化可能的模式圖

除控制液泡酸化之外，PH基因還在花青素合成通路、花器官著色細胞小型液泡類似物vacuolino與中央大液泡融合以及花器官發(fā)育等其它方面起著特殊作用。

PH1與膜蛋白運輸有關。在矮牽?；ü谥毎c月季的花瓣表皮著色細胞中，發(fā)現(xiàn)了一類在花器官表皮著色細胞中存在、而在葉肉細胞中并不存在的液泡類似物vacuolino。復合質(zhì)子泵PH1-PH5出現(xiàn)在vacuolino膜上，中央大液泡上的蛋白受體識別PH1后，二者形成鏈栓結構，相互融合，PH1-PH5進入之前無這兩種蛋白的中央大液泡，這是一種膜蛋白運輸方式的分支。矮牽牛突變體ph3和ph4中，vacuolinos無法產(chǎn)生；ph1突變體中vacuolinos與中央大液泡無法融合。

矮牽牛PH3基因與擬南芥TTG2基因高度同源且功能上可以互相代替，由于TTG2參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累和液泡酸化，因此PH3基因除了液泡酸化功能外，也參與植株毛狀物的形成以及原花青素積累。

矮牽牛中純合ph3會導致雌性不育，且會遏制F3′5′H基因的表達；花褪色顯性等位基因Fa，只在ph3ph3和ph4ph4背景下表達；隨著矮牽?；ü诘睦匣?，變紫的背景下出現(xiàn)的紅色斑點與扇區(qū)和ph7有關。

另外，PH基因還參與果實風味調(diào)控。從柑橘果實液囊中分離出CsPH5，CsPH5為PhPH5的同源基因，主要負責向果肉液囊中泵入氫離子，提高果實風味。但甜瓜中的PH基因編碼的蛋白相似性最高的蛋白是PINs家族的蛋白，即H+/auxin泵，且該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，基因沉默后并未發(fā)生生長素缺失的表型。

對這兩種調(diào)控植物花器官與果實器官酸度的不同基因家族的研究表明，不同植物、不同部位PH基因需要深入研究其功能與意義。