研究簡介:介紹了一種新型的非侵入式、高靈敏度微傳感器系統(tǒng)，用于測量牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率，并探討其與胚胎形態(tài)、直徑、性別及發(fā)育階段的相關(guān)性。傳統(tǒng)胚胎質(zhì)量評估主要依賴形態(tài)學(xué)評價，但這種方法主觀性強且難以準(zhǔn)確判斷中等質(zhì)量胚胎的發(fā)育潛力。因此本研究旨在開發(fā)一種更客觀、準(zhǔn)確的胚胎質(zhì)量評估方法。研究使用了第3天的8細(xì)胞期胚胎和第7天的囊胚期胚胎，通過新型微傳感器系統(tǒng)測量其呼吸速率。該系統(tǒng)基于微型氧氣傳感器，通過檢測胚胎在玻璃毛細(xì)管中產(chǎn)生的線性穩(wěn)態(tài)氧氣梯度來計算呼吸速率。實驗結(jié)果表明，第7天囊胚的平均呼吸速率顯著高于第3天胚胎，且呼吸速率與胚胎直徑呈正相關(guān)。此外第7天囊胚的呼吸速率與其質(zhì)量等級相關(guān)，質(zhì)量等級為1的囊胚呼吸速率最高，而不同性別的胚胎呼吸速率無顯著差異。本研究提供了一種快速、準(zhǔn)確且非侵入式的胚胎呼吸速率測量方法，能夠在短時間內(nèi)完成單個胚胎的代謝活動評估。呼吸速率作為一種客觀的代謝指標(biāo)，與胚胎形態(tài)學(xué)評估相結(jié)合，有望進一步提高胚胎分類和選擇的準(zhǔn)確性，從而為胚胎移植的成功率提供更可靠的預(yù)測依據(jù)。未來的研究將進一步驗證呼吸速率在胚胎發(fā)育潛能評估中的應(yīng)用價值，并探索其在動物胚胎生產(chǎn)和人類輔助生殖技術(shù)中的潛在應(yīng)用。

Unisense超微呼吸極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense超呼吸測量系統(tǒng)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它為研究者提供了一種高靈敏度、非侵入式且快速準(zhǔn)確的手段來測量牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率。Unisense超系統(tǒng)的核心是一個微型氧氣傳感器（OX50），其尖端直徑僅為40–60μm。這種微型化設(shè)計使得傳感器能夠精確地測量微小空間內(nèi)的氧氣濃度變化。傳感器的響應(yīng)時間小于5秒，且自身氧氣消耗可以忽略不計，這確保了測量結(jié)果的高精度和可靠性。Unisense系統(tǒng)通過將胚胎放置在玻璃毛細(xì)管底部，利用傳感器測量毛細(xì)管內(nèi)的氧氣濃度梯度，從而實現(xiàn)了非侵入式測量。這種方法不會對胚胎造成損傷，也不會干擾胚胎的正常發(fā)育。在短時間內(nèi)完成對單個胚胎的呼吸速率測量。在本研究中，每個胚胎的測量過程僅需約8分鐘，這使得研究者能夠在短時間內(nèi)對大量胚胎進行測量。此外本系統(tǒng)的設(shè)計允許同時測量多個胚胎，進一步提高了實驗效率。

實驗結(jié)果

驗證了一種新型高分辨率微電極技術(shù)，用于測定不同發(fā)育階段單個胚胎的呼吸速率。我們利用該技術(shù)研究了呼吸速率與胚胎形態(tài)、直徑和性別之間的相關(guān)性。研究表明，第7天的囊胚期胚胎的平均呼吸速率（1.30±0.064 nl/h）顯著高于第3天的8細(xì)胞期胚胎（0.38±0.011 nl/h），表明隨著胚胎發(fā)育，其代謝活動顯著增強。這種差異反映了胚胎在不同發(fā)育階段的能量需求變化。對于第7天的囊胚，質(zhì)量等級為1的胚胎呼吸速率顯著高于其他質(zhì)量等級的胚胎。具體而言，質(zhì)量等級為1的胚胎呼吸速率為1.72±0.18 nl/h，而質(zhì)量等級為2、3和4的胚胎呼吸速率分別為1.23±0.14 nl/h、1.07±0.14 nl/h和0.81±0.22 nl/h。這表明呼吸速率與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)，高質(zhì)量胚胎通常具有更高的呼吸速率。胚胎的呼吸速率與其直徑直接相關(guān)，直徑較大的胚胎具有更高的呼吸速率。這種關(guān)系可能與胚胎的代謝需求和能量消耗有關(guān)，較大的胚胎需要更多的氧氣來維持其代謝活動。在第3天和第7天的胚胎中，呼吸速率在不同性別的胚胎之間沒有顯著差異。這表明性別對胚胎的呼吸速率影響較小，呼吸速率主要與胚胎的發(fā)育階段和質(zhì)量相關(guān)。呼吸速率作為一種客觀的代謝指標(biāo)，可以與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評估相結(jié)合，進一步提高胚胎分類和選擇的準(zhǔn)確性。這種結(jié)合評估方法有望為胚胎移植的成功率提供更可靠的預(yù)測依據(jù)，減少失敗妊娠和多胎妊娠的風(fēng)險。結(jié)果表明，unisense超微呼吸系統(tǒng)可用于準(zhǔn)確、快速(8分鐘)測量不同發(fā)育階段單個胚胎的呼吸速率。呼吸速率與胚胎形態(tài)只有部分吻合，這表明這兩種方法在評估胚胎質(zhì)量方面略有差異。對胚胎呼吸和形態(tài)進行綜合評估可能會改進胚胎分類和后續(xù)篩選工作。

圖1、完整的超微呼吸系統(tǒng)。溫控水浴通過兩根硅膠管(圖中未顯示)與玻璃培養(yǎng)室中的加熱螺旋進一步連接。MMS；微機械手系統(tǒng)。

圖2、(A)帶有胚胎的單根花環(huán)毛細(xì)管示意圖，(B)從上往下看組成“花環(huán)”的七根熔融玻璃毛細(xì)管，(C)納米吸氣裝置?；ōh(huán)安裝在中央花環(huán)盤中，可以旋轉(zhuǎn)花環(huán)盤，使另一根毛細(xì)管與電極對齊。圓盤上的數(shù)字用于跟蹤正在研究的毛細(xì)管。電極位于毛細(xì)管上方。承載圓盤的聚砜圓筒和左側(cè)的桿是圓盤支架，測量時將其浸入裝有介質(zhì)的燒杯中。

圖3、由5個第7天胚泡的呼吸速率產(chǎn)生的氧梯度記錄。對照梯度相當(dāng)于空毛細(xì)管中的測量值，作為負(fù)參考(=無呼吸活動)。每個梯度的斜率針對每個胚胎。

圖4、對同一胚胎進行的第一次和第二次氧氣測量之間的關(guān)系，測量間隔為76±8分鐘。

圖5、呼吸速率與第7天體外生產(chǎn)的牛囊胚直徑之間的關(guān)系。

結(jié)論與展望

本研究通過引入一種新型的高分辨率微傳感器測試系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了對牛體外生產(chǎn)胚胎呼吸速率的非侵入式、快速且準(zhǔn)確的測量。研究結(jié)果表明，呼吸速率可以作為一種有效的胚胎質(zhì)量評估指標(biāo)，尤其是在結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評估時，能夠進一步提高胚胎分類和選擇的準(zhǔn)確性。unisense超微呼吸系統(tǒng)具有高精度、高重復(fù)性和非侵入性的特點。實驗結(jié)果表明，兩次測量的呼吸速率高度一致（R2=0.9705），且系統(tǒng)在空毛細(xì)管中的氧氣消耗極低（0.034±0.055 nl/h），表明系統(tǒng)具有極低的背景干擾和測量誤差。研究結(jié)果表明，胚胎的呼吸速率與其發(fā)育階段、形態(tài)學(xué)質(zhì)量以及直徑密切相關(guān)。通過使用新型微傳感器系統(tǒng)成功測量了牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率，并驗證了其在胚胎質(zhì)量評估中的潛在應(yīng)用價值。這種技術(shù)為胚胎評估提供了一種新的、客觀的手段，有望推動胚胎評估技術(shù)向更加科學(xué)、精準(zhǔn)的方向發(fā)展。