近年來(lái)，隨著多學(xué)科交叉的深入發(fā)展及微納加工技術(shù)的進(jìn)步，微流控技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由于微流控芯片具有小型化的特點(diǎn)，特征尺寸與細(xì)胞尺度相近、成本低、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活且易于與其他檢測(cè)分析手段集成，因此被廣泛用于單細(xì)胞分析。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也稱為出芽酵母，作為一種重要的模式生物，在現(xiàn)代生物學(xué)研究中具有重要意義。而微流控芯片則為酵母單細(xì)胞分析提供了便捷又精準(zhǔn)的研究平臺(tái)。

目前，微流控芯片中酵母細(xì)胞的監(jiān)測(cè)方法主要是光學(xué)顯微成像技術(shù)。通過(guò)高分辨顯微鏡能夠獲得出芽酵母單細(xì)胞的形態(tài)、尺寸、生長(zhǎng)速率、子細(xì)胞剪切等信息。利用熒光蛋白標(biāo)記亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(液泡、細(xì)胞核、線粒體等)，還能獲得酵母細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。然而，高分辨率時(shí)序顯微成像技術(shù)的通常需要熒光標(biāo)記，對(duì)細(xì)胞的正常生理過(guò)程存在一定的影響；此外，大批量的圖像處理耗時(shí)耗力。

相比于顯微成像技術(shù)，電阻抗譜(Electrical impedance spectroscopy，EIS)具有非侵入性、無(wú)需熒光標(biāo)記、快速檢測(cè)、多參數(shù)讀取等特點(diǎn)。電阻抗譜檢測(cè)功能可通過(guò)微電極集成在微流控芯片中，通過(guò)檢測(cè)單細(xì)胞的介電特性表征細(xì)胞尺寸、生長(zhǎng)狀態(tài)等。例如，Haandbaek等在微流控芯片中集成微電極，并根據(jù)電阻抗信號(hào)對(duì)流經(jīng)微流體通道的酵母細(xì)胞的出芽狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分。Zhu等提出一種可以捕獲酵母單細(xì)胞的微流控芯片，并通過(guò)電阻抗對(duì)單個(gè)出芽酵母的生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)、區(qū)分。然而，現(xiàn)有的研究成果還無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)出芽酵母的高通量、長(zhǎng)時(shí)間的EIS監(jiān)測(cè)。因此，用于出芽酵母長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、原位時(shí)序電阻抗監(jiān)測(cè)的高通量微流控芯片尚待研究。

本研究提出一種集成高通量酵母單細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)及微電極陣列的微流控芯片，建立微流控芯片及酵母細(xì)胞的三維有限元模型，分析模型內(nèi)電流分布情況以及不同行列間距下鄰近細(xì)胞對(duì)于待測(cè)細(xì)胞EIS信號(hào)的影響?？紤]到陣列集成度及檢測(cè)靈敏度的需求，根據(jù)仿真分析結(jié)果探索微電極陣列的最優(yōu)行列間距，對(duì)基于電阻抗譜的微流控酵母檢測(cè)芯片的設(shè)計(jì)優(yōu)化具有重要意義。

1原理和方法

1.1微流控芯片的結(jié)構(gòu)及工作原理

如圖1(a)所示，微流控芯片由玻璃襯底、鉻-金微電極陣列、氮化硅絕緣層、SU-8光刻膠捕獲-剪切結(jié)構(gòu)等組成。微電極陣列是酵母細(xì)胞EIS檢測(cè)的核心結(jié)構(gòu)。如圖1(b)、圖1(b)所示，微電極陣列由列電極(紅色部分)和行電極(藍(lán)色部分)交叉排列而成，SU-8捕獲-剪切結(jié)構(gòu)則分布于每個(gè)行列電極交叉處。所有行列電極寬度均為10μm。列電極與行電極表面有一層氮化硅絕緣層，在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)上下游分別形成長(zhǎng)為15μm，寬為8μm的圓角矩形開(kāi)孔，用于對(duì)出芽酵母的電阻抗檢測(cè)。氮化硅絕緣層能夠有效避免微電極陣列間的電流串?dāng)_，提高電阻抗檢測(cè)的靈敏度。每個(gè)捕獲-剪切結(jié)構(gòu)以及與之對(duì)應(yīng)的絕緣層開(kāi)孔處的微電極對(duì)即為一個(gè)酵母細(xì)胞的捕獲檢測(cè)單元。相鄰捕獲檢測(cè)單元的列間距設(shè)為Δx、行間距設(shè)為Δy。如圖1(b)、圖1(c)所示，捕獲-剪切結(jié)構(gòu)由2根對(duì)稱的SU-8微柱組成，微柱高為8.3μm，2根微柱的下游開(kāi)孔寬度為3μm，與上下游氮化硅開(kāi)孔距離均為6μm。圖1(c)為捕獲檢測(cè)單元沿AA′的截面示意圖，行列電極的厚度均為0.2μm，氮化硅層的總厚度為1μm。具體地，列電極位于玻璃襯底表面，行電極位于厚度為0.5μm的第一層氮化硅上表面。

圖1微流控芯片幾何結(jié)構(gòu)圖

如圖1(b)所示，出芽酵母細(xì)胞以出芽方式進(jìn)行增殖。母細(xì)胞被流體動(dòng)力固定在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)中，子細(xì)胞在下游開(kāi)孔外出芽生長(zhǎng)，并最終被流體剪切去除。SU-8捕獲-剪切結(jié)構(gòu)、被捕獲的出芽酵母細(xì)胞以及周?chē)呐囵B(yǎng)液構(gòu)成一個(gè)等效電路系統(tǒng)，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及子細(xì)胞的剪切均會(huì)改變系統(tǒng)的電阻抗。通過(guò)捕獲檢測(cè)單元上下游的微電極對(duì)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)電阻抗的檢測(cè)，其原理是對(duì)上游激勵(lì)電極施加幅值固定的交流電壓并記錄下游響應(yīng)電極的電流響應(yīng)，基于歐姆定律計(jì)算出系統(tǒng)的電阻抗。幅值、頻率一定的激勵(lì)信號(hào)記為，響應(yīng)電流記為，則該系統(tǒng)的復(fù)阻抗為:

對(duì)捕獲檢測(cè)單元中的出芽酵母進(jìn)行電阻抗檢測(cè)時(shí)，施加激勵(lì)信號(hào)至與之對(duì)應(yīng)的列電極，并檢測(cè)相應(yīng)行電極的響應(yīng)電流信號(hào)。按照行列尋址的方式選擇不同的行列電極組合，能夠?qū)崿F(xiàn)陣列中所有出芽酵母的電阻抗檢測(cè)。根據(jù)式(1)，在激勵(lì)信號(hào)不變的情況下，響應(yīng)電流的變化能夠反映系統(tǒng)復(fù)阻抗的變化，進(jìn)而揭示待測(cè)出芽酵母的相關(guān)信息，如細(xì)胞的尺寸變化、子細(xì)胞的剪切等。