研究簡介:反硝化作用在全球碳氮循環(huán)中占據(jù)重要地位，但不完全反硝化產(chǎn)生的N?O會加劇氣候變暖。在許多河口、沿海地區(qū)及海洋缺氧區(qū)域，硫循環(huán)對生物地球化學(xué)過程影響重大，其中硫化物會抑制反硝化活性并增加N?O排放。以往觀點認(rèn)為，化能自養(yǎng)反硝化菌主導(dǎo)硫化合物氧化和硫化物解毒過程，然而近期研究發(fā)現(xiàn)部分化能異養(yǎng)反硝化菌（F-SOHDs）也具備硫化物氧化能力，但其在自然生態(tài)系統(tǒng)中的存在和生態(tài)作用尚不明確。本研究以松花江口水體和沉積物為研究對象，綜合運用微宇宙培養(yǎng)、DNA穩(wěn)定同位素探測（DNA-SIP）、定量PCR、宏基因組測序等技術(shù)，深入探究異養(yǎng)反硝化菌對硫化物的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，硫化物和有機物均可促進河口沉積物中硝酸鹽的還原。DNA-SIP實驗顯示，Thauera、Azoarcus和Pseudomonas等異養(yǎng)反硝化菌參與了硫氧化和反硝化過程。宏基因組測序結(jié)果表明，部分微生物具備近完整的反硝化或DNRA途徑，同時編碼多種硫氧化酶。長期富集培養(yǎng)實驗證實，F(xiàn)-SOHDs在有無硫化物的環(huán)境下均能生長并進行反硝化，且有機物對其硫氧化作用至關(guān)重要。此外F-SOHDs能高效消耗硫化物，將其作為替代電子供體促進完全反硝化，能夠顯著降低N?O排放。本研究首次揭示了河口沉積物中F-SOHDs的存在，明確了其在硫氧化和反硝化過程中的重要作用，為理解微生物群落的生態(tài)功能提供了新視角，對調(diào)控碳、氮、硫循環(huán)以及減少N?O排放具有重要意義，同時也為后續(xù)相關(guān)研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

使用Unisense SULF-100和N?O-100型微電極傳感器，對不同培養(yǎng)物實驗過程中液相的可溶性H?S和N?O濃度進行連續(xù)監(jiān)測。在探究F-SOHDs對硫和氮循環(huán)影響的實驗中，通過自動采樣針和這兩個預(yù)校準(zhǔn)的微傳感器，持續(xù)收集相關(guān)濃度數(shù)據(jù)。這些實時監(jiān)測的數(shù)據(jù)，通過Unisense微傳感器獲取的H?S和N?O濃度數(shù)據(jù)，結(jié)合其他實驗數(shù)據(jù)，能夠計算出多個重要參數(shù)。利用這些數(shù)據(jù)，可以深入分析F-SOHDs在不同環(huán)境條件下的代謝過程，以及對硫和氮循環(huán)的具體貢獻(xiàn)。計算出硫化物作為電子供體對完全反硝化的貢獻(xiàn)比例，評估反硝化過程的完成程度，全面地了解F-SOHDs在生態(tài)系統(tǒng)中的作用機制。

實驗結(jié)果

本研究揭示了一類多功能的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌（在河口沉積物中的存在及其生態(tài)功能。這些細(xì)菌能夠通過化學(xué)自養(yǎng)異養(yǎng)代謝將硫氧化與反硝化耦合，從而在硫化物存在的情況下生存并減少一氧化二氮（N2O）的排放。研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌（如Azoarcus和Pseudomonas）能夠利用硫化物作為電子供體進行反硝化。這些細(xì)菌不僅能夠氧化硫化物以解毒，還能通過這一過程獲取能量，支持其生長和反硝化功能。這種能力使它們能夠在富含硫化物的環(huán)境中生存，同時減少N2O的排放。F-SOHDs在硫化物存在的情況下表現(xiàn)出顯著的生態(tài)優(yōu)勢。它們能夠在硫化物和有機物的共同作用下加速反硝化過程，并顯著減少N2O的排放。此外，這些細(xì)菌在硫化物存在和缺失的條件下均能生存，顯示出較強的環(huán)境適應(yīng)能力。F-SOHDs通過氧化硫化物，不僅減少了硫化物的毒性，還為反硝化過程提供了額外的電子供體，從而促進了完整的反硝化過程，減少了溫室氣體N2O的排放。

圖1、河口沉積物的功能特性和注入反應(yīng)動力學(xué)。a)河口沉積物微觀世界中硫酸鹽還原活性的評估（三個生物重復(fù)）。沉積物與缺氧的上覆水一起孵育。b)使用qPCR定量沉積物中與硫酸鹽還原、硫化物氧化和硝酸鹽還原相關(guān)的生物標(biāo)志物的基因拷貝。硝酸鹽還原包括反硝化和異化硝酸鹽還原為銨（DNRA）過程。c)通過提供硝酸鹽和硫化物促進硝酸鹽減少（三次生物學(xué)重復(fù)）。藍(lán)色圓圈表示補充硫化物時的消耗量。未添加硫化物的孵育中的硫化物水平低于檢測水平。d)通過提供硝酸鹽和有機物（OM）促進硝酸鹽減少（3次生物重復(fù)）。

圖2、DNA穩(wěn)定同位素探測（DNA-SIP）揭示的河口沉積物中的碳、氮和硫循環(huán)。DNA-SIP圖譜顯示通過qPCR確定的群落16S rRNA基因的浮力密度分布，用于用+C+N+S（a）和+C+N（b）處理的孵育。C表示提供無機（C）和有機（CO）碳。C和Co表示提供的無機碳（CO2加碳酸氫鹽）和有機碳（葡萄糖、丙酸鹽和乙酸鹽），而N和S表示添加的硝酸鹽（NO3?）和硫化物（S2?）。水平虛線表示重餾分和輕餾分之間的分界線。(c-g)重DNA組分的微生物群落組成，分別在+C+N+S、+C+S、+C+N、O、+C+N+S和+C微觀世界中進行同位素標(biāo)記。(h，i)未標(biāo)記12 C和標(biāo)記13 C孵育沿DNA密度梯度的sqr基因豐度。對于每個浮力密度分?jǐn)?shù)，基因豐度被歸一化為其拷貝數(shù)相對于總DNA拷貝數(shù)的百分比。有和沒有同位素標(biāo)記的峰基因豐度以青色和灰色突出顯示。(j)三個13Co標(biāo)記的微觀世界中sqr基因總拷貝數(shù)的比較（雙尾未配對學(xué)生t檢驗，來自三個技術(shù)重復(fù)的95%置信區(qū)間）。數(shù)據(jù)在SEM±表示為平均值。(k、l)未標(biāo)記12 C和標(biāo)記13 C的孵育沿DNA密度梯度的nirS基因豐度。m比較三個13Co標(biāo)記的微觀世界中nirS基因的總拷貝數(shù)。

圖3、推定的F-SOHD的同位素和基因組知情富集和生理動力學(xué)。a)用于長期富集F-SOHD的定制策略。河口沉積物（簡稱START）用作接種。b，c)提供不同底物的ENR_C4富集的反應(yīng)動力學(xué)。在Co+N和Co+N+S處理中，OM作為唯一的碳源，而C+N+S處理則依賴于無機碳的供應(yīng)。在硝酸鹽和亞硝酸鹽耗盡63小時時提供溶解的硫化物和新鮮硝酸鹽。d，e)在不同孵育條件下ENR_C4和ENR_U2細(xì)胞數(shù)的凈增加率.

圖4、F-SOHDs對生物地球化學(xué)循環(huán)和一氧化二氮（N2O）排放的影響。a）在富含OM和OM限制的條件下在不同實驗室培養(yǎng)物中去除硫化物。在OM限制的條件下，ENR_U2和ENR_C4實驗重復(fù)3次，硫化物的最終濃度始終低于檢測限。b）來自硫化物（綠框）和OM（虛線）的電子對富含OM的培養(yǎng)物中反硝化過程的貢獻(xiàn)。計算是在硝酸鹽完全還原為二氮氣的假設(shè)下進行的。c）來自O(shè)M限制的培養(yǎng)物中來自硫化物（綠框）和OM（虛線）的電子對反硝化作用的貢獻(xiàn)。淺藍(lán)色框表示反硝化作用的完成程度（即產(chǎn)生的電子百分比作為將硝酸鹽完全還原為二氮所需的總電子的函數(shù)）?；疑虮硎驹跊]有OM的情況下反硝化的完成程度。d）在富含OM和OM限制的條件下，各種實驗室培養(yǎng)物的OM代謝。OM消耗量的比較是在假設(shè)每個實驗室培養(yǎng)物中的總電子供體足以支持完全反硝化e、f）富含OM的條件下，在存在或不存在硫化物的情況下，通過常規(guī)異養(yǎng)反硝化劑的富集培養(yǎng)物發(fā)射N2O和N2。g）N2O在富含OM和OM限制的條件下各種實驗室培養(yǎng)物的排放。

圖5、ENR_C4富集的動力學(xué)實驗、細(xì)胞數(shù)量和微生物群落。a-i），硫氧化和有機物（OM）代謝伴隨著硝酸鹽還原的反應(yīng)動力學(xué)。采用還原硫化物（-2）、溶解零價硫（0）、硫代硫酸鹽（+2）和亞硫酸鹽（+4）的不同價硫化合物來測試推測的硫支持的異養(yǎng)反硝化代謝。零價硫溶液是由溶解的多硫化物和脫氮錐蟲25259產(chǎn)生的生物硫的混合物制備的。j）硫氧化代謝途徑與異養(yǎng)反硝化耦合的完整性。紅色勾號表示存在目標(biāo)硫氧化能力。k）全長16S rRNA基因擴增子文庫富集ENR_C4物種水平群落組成。

結(jié)論與展望

本論文研究了異養(yǎng)反硝化細(xì)菌在硫循環(huán)中的作用及其對溫室氣體排放的影響。異養(yǎng)反硝化細(xì)菌在碳和氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，但其對硫化物的耐受性較差，硫化物會抑制關(guān)鍵的反硝化酶反應(yīng)，導(dǎo)致溫室氣體一氧化二氮（N2O）排放增加。研究團隊通過微宇宙培養(yǎng)、DNA穩(wěn)定同位素探針（DNA-SIP）和宏基因組學(xué)等方法，揭示了在河口沉積物中存在一群多功能的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，它們能夠通過化學(xué)自養(yǎng)異養(yǎng)代謝將硫氧化與反硝化耦合，從而在富含硫化物的環(huán)境中生存，并顯著減少N2O的排放。Unisense微電極系統(tǒng)中被用于連續(xù)監(jiān)測實驗體系中溶解態(tài)N2O和H2S的濃度變化。提供了高精度的N2O和H2S的實時監(jiān)測數(shù)據(jù)，幫助了研究人員深入了解微生物群落的代謝過程，還為評估F-SOHDs在硫循環(huán)和溫室氣體排放調(diào)控中的作用提供了有力支持。因為這些數(shù)據(jù)對于揭示F-SOHDs的生態(tài)功能和潛在應(yīng)用價值具有重要意義。揭示了異養(yǎng)反硝化細(xì)菌在硫循環(huán)中的隱藏貢獻(xiàn)，還強調(diào)了它們在減少溫室氣體排放方面的潛在作用。這些發(fā)現(xiàn)為理解微生物群落中異養(yǎng)反硝化細(xì)菌的生態(tài)角色提供了新的視角，并為河口生態(tài)系統(tǒng)中硫、碳和氮循環(huán)的調(diào)控提供了重要的科學(xué)依據(jù)。